胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜对犬血管内皮细胞的毒性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.51.018

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (51): 8894-8900.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.51.018

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胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜对犬血管内皮细胞的毒性

程光存¹，李春生¹，严宇¹，王岚¹，严中亚¹，罗乐²，方晓东³，陶汝华³

¹安徽医科大学附属省立医院心脏外科，安徽省心血管病研究所，安徽省合肥市 230001；²合肥工业大学，安徽省合肥市 230009；³中国科学院安徽光学精密机械研究所，安徽省合肥市 230031

出版日期:2013-12-17 发布日期:2013-12-17
通讯作者: 严中亚，硕士，教授，主任医师，安徽医科大学附属省立医院心脏外科，安徽省心血管病研究所，安徽省合肥市 230001 yan20047@163.com
作者简介:程光存★，男，1966年生，安徽省皖舒城县人，汉族，2004年安徽医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事心脏外科的基础和临床研究。 cunguangcheng@163.com
基金资助:
安徽省自然科学基金项目(1308085MH143)*

Toxicity assessment of hydroxyapatite-coated mechanical heart valve embedded with collagen to vascular endothelial cells

Cheng Guang-cun¹, Li Chun-sheng¹, Yan Yu¹, Wang Lan¹, Yan Zhong-ya¹, Luo Le², Fang Xiao-dong³, Tao Ru-hua³

¹Department of Cardiac Surgery, Anhui Provincial Hospital of Anhui Medical University, Anhui Institute of Cardiovascular Disease, Hefei 230001, Anhui Province, China; ²Hefei University of Technology, Hefei 230009, Anhui Province, China; ³Anhui Institute of Optics and Fine Mechanics, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031, Anhui Province, China

Online:2013-12-17 Published:2013-12-17
Contact: Yan Zhong-ya, Master, Professor, Chief physician, Department of Cardiac Surgery, Anhui Provincial Hospital of Anhui Medical University, Anhui Institute of Cardiovascular Disease, Hefei 230001, Anhui Province, China yan20047@163.com
About author:Cheng Guang-cun★, Master, Associate chief physician, Department of Cardiac Surgery, Anhui Provincial Hospital of Anhui Medical University, Anhui Institute of Cardiovascular Disease, Hefei 230001, Anhui Province, China cunguangcheng@163.com
Supported by:
the Natural Science Foundation of Anhui Province, No. 1308085MH143*

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期实验利用脉冲激光沉积方法制作了胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜。
目的：进一步分析胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜的组织相容性和毒性。
方法：将传代的犬血管内皮细胞悬液接种在胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜材料上，1组置于含体积分数5%CO₂、37 ℃恒温培养箱内静态培养3周，另1组置于含体积分数5%CO₂、37 ℃恒温培养箱动态旋转培养3周，扫描电子显微镜下观察细胞在材料上的附着情况。采用MTT法测定血管内皮细胞与胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜材料复合培养的增殖能力。
结果与结论：动态旋转培养中见人工机械瓣膜材料的表面有细胞附着，并且数目比静态培养多，细胞分布均匀，在培养第21 天可见均匀细胞融合成片，将材料表面均匀覆盖；在静态培养中细胞成堆，分布不均匀。人工机械瓣膜材料对犬血管内皮细胞增殖无明显影响，细胞生长良好。表明胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜材料对血管内皮细胞的增殖无明显影响，无明显毒性，具有良好的生物相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 细胞外基质材料, 组织工程血管材料, 脉冲激光沉积, 胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜, 组织工程, 犬血管内皮细胞, 细胞培养, 四唑盐(MTT)比色法, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: In early experiments, we prepared hydroxyapatite-coated mechanical heart valve embedded with collagen using impulse laser sediment method.
OBJECTIVE: To further analyze the histocompatibility and toxicity of hydroxyapatite-coated mechanical heart valve embedded with collagen.
METHODS: After passage, canine vascular endothelial cell suspension was inoculated onto the hydroxyapatite-coated mechanical heart valve embedded with collagen. One group was inoculated in 5% CO2, 37 ℃ incubator for 3 weeks static culture, and the other group was inoculated in 5% CO2, 37 ℃ incubator for 3 weeks spinner culture. Scanning electron microscope was used to observe cell attachment on the material. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay was used to the proliferative capacity of vascular endothelial cells cultured with the hydroxyapatite-coated mechanical heart valve embedded with collagen.
RESULTS AND CONCLUSION: During the spinner culture, adherent cells were found on the surface of mechanical heart valve, and the cells distributed evenly and confluent at 21 days to cover the surface of the material. The number of adherent cells in the spinner culture was higher than that in the static culture. The cells during the static culture were aggregated and distributed irregularly. The mechanical heart valve exhibited no effects on the proliferation of canine vascular endothelial cells which grew well. These findings indicate that the hydroxyapatite-coated mechanical heart valve embedded with collagen exert no effect on proliferation of vascular endothelial cells, has no toxicity and has good biocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, tissue engineering, heart valves, hydroxyapatites

中图分类号:

R318

程光存，李春生，严宇，王岚，严中亚，罗乐，方晓东，陶汝华. 胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜对犬血管内皮细胞的毒性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(51): 8894-8900.

Cheng Guang-cun, Li Chun-sheng, Yan Yu, Wang Lan, Yan Zhong-ya, Luo Le, Fang Xiao-dong, Tao Ru-hua. Toxicity assessment of hydroxyapatite-coated mechanical heart valve embedded with collagen to vascular endothelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(51): 8894-8900.

图/表（结果） 6

2.1 倒置显微镜观察血管内皮细胞 细胞传代接种后24 h可见部分大圆形单核细胞贴壁；3 d时贴壁较多，呈梭形，铺路石样，散在分布；五六天时细胞增多，以后随着细胞数的增多，细胞间相互接触，排列紊乱； 7-10 d时细胞基本铺满瓶底，多为梭形，见图1。

2.2 细胞与人工机械瓣膜复合培养结果见图2。

在倒置显微镜下无法观察到接种于材料表面的细胞贴附形态，早期可见材料周边、孔隙内有少量细胞，生长良好，有正常的分裂增殖表现，随着培养时间的延长见细胞增多并沿着材料周边密集生长，细胞形态多为梭形，无细胞衰老及异常分裂现象，接种后24 h观察材料上静态培养和动态培养细胞无差异。

2.3 扫描电镜观察人工机械瓣膜上的血管内皮细胞 在静态及动态培养中复合培养3 d时和7 d时两组情况相似，都可以见材料表面有细胞附着，细胞已伸展成梭形或多角形，伸出伪足黏附于材料上，见图3A；可见材料表面细胞充分伸展，细胞相互连接融合，见图3B。第21 天在静态及动态培养中扫描电镜观察两组情况有差异，在动态旋转培养装置复合培养后见材料表面有细胞附着且数目比静态培养增多，细胞分布均匀，在动态旋转培养第21天可见均匀细胞融合成片，将材料表面均匀覆盖，见图4，在第21天可见静态培养中可见细胞成堆，分布不均匀并将材料表面不均匀覆盖，见图5。

2.4 苏木精-伊红染色结果见图6，7。

在特制动态旋转培养装置中血管内皮细胞层完整，细胞分布均匀，见图6；在静态培养系统中看到血管内皮细胞层不完整，细胞分布不均匀，见图7。

2.5 MTT法检测细胞增殖结果 将两材料浸提液组与阴性对照组进行两两比较，各组对细胞的增殖均无明显影响(P > 0.05)，各组与阳性对照组进行两两比较显示差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

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引言

在中国心脏瓣膜病约占心脏病的30%，每年大约有10万例患者需要进行心脏换瓣手术。目前，应用于临床治疗的人工心脏瓣膜主要有生物瓣和机械瓣两种。生物瓣具有很好的生物相容性，置入后不需或只需短期抗凝；但是由于生物瓣容易钙化、衰败、破损撕裂等原因使得它的使用寿命很短，从而严重限制了它的临床应用范围。现在所使用的人工机械瓣膜材料主要是热解碳，但热解碳并不是理想的材料，尽管在瓣膜的制作方面已经有了很大的进步，仍然不能完全避免血栓的形成。当血液与机械瓣膜直接接触时便激活了血小板，从而导致血栓形成，所以血栓形成仍然是主要问题^[1-5] ，术后需终生服用抗凝药以防止血栓形成^[6] 。如果抗凝药使用不当，又可引起身体重要脏器的栓塞，抗凝过量容易引起出血倾向，因此，如能获得临床上理想的人工机械瓣膜，使瓣膜上无血栓形成，将解除心血管患者术后需终生服用抗凝药物的痛苦^[7-11] 。
组织工程心脏瓣膜就是采用组织工程学方法把细胞种植在心脏瓣膜支架上并培养生长，在体外培养出具有完全功能的心脏瓣膜，植入体内后细胞仍可以存活，可以和自体内皮细胞相互融合，使细胞覆盖整个心脏瓣膜，促进完全内皮化，从而实现组织工程心脏瓣膜无免疫原性、无需抗凝、可以生长、可以修复自身损伤的优点。利用脉冲激光方法沉积胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜，可以为进一步为实现组织工程化心脏瓣膜提供理论依据。
胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜属于生物工程及材料科学技术领域，首先制备纳米径粒羟基磷灰石，然后制备胶原，应用脉冲激光沉积方法在人工心脏机械瓣膜上沉积胶原包埋羟基磷灰石涂层，该材料具有传导作用强、孔隙率高、孔隙交通好等优点，有利于细胞生长；生物相容性好，pH值中性，降解过程无酸性反应，不会引起非感染性炎症或排斥反应，其中的胶原在被机体降解吸收过程中可为细胞的长入不断腾出空间，为瓣膜外科手术提供了一种优质的全新植入材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：对比观察细胞学实验。

时间及地点：于2012年10月至2013年4月在安徽医科大学医学工程实验室，安徽省立医院中心实验室安徽医科大学中心实验室，安徽医科大学动物实验中心完成。

材料：

瓣膜材料：胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜由合肥大学和中国科技大学联合应用脉冲激光沉积方法在人工心脏机械瓣膜上沉积胶原包埋羟基磷灰石涂层，脉冲激光沉积技术是近年发展起来的一项新的制膜技术，它是把激光聚焦照射在靶材的表面，使固体靶材转变成等离子体，等离子体沿法线方向在极短的时间内向外膨胀形成一个细长的等离子体羽辉。等离子体羽辉和基底表面相互作用沉积成膜，利用这种方法沉积胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜，该材料为合肥大学材料系和中科院安徽光学密精机械研究所联合研究的新型合成瓣膜材料，将材料制备成10 mm×5 mm×1 mm、10 mm×5 mm×5 mm和5 mm×5 mm×1 mm大小，环氧乙烷消毒。

实验动物：8月龄健康成年雄性犬12只，体质量12- 16 kg，购自安徽医科大学实验动物中心，由安徽医科大学实验动物中心提供并喂养。

实验方法：

犬血管内皮细胞的分离培养与鉴定：对实验犬1-12进行编号，用3%戊巴比妥30 mg/kg(即1 mL/kg)缓慢注入血管内麻醉^[12]，观察犬的反应，待犬肌肉紧张度逐渐消失，角膜反应迟钝，对皮肤刺激无反应，呼吸平稳后，放置在手术台上侧卧位固定，前肢悬吊，备皮消毒后开始手术。取前肢8-12 cm长度的隐静脉，以M199培养液冲洗血管3次，直至无血液细胞残留，以10 mL 1 g/L Ⅰ型胶原酶灌注进隐静脉内，使血管呈充盈状态，结扎两端，放入无菌细胞培养皿中，37 ℃恒温水浴30 min，细胞培养室超净台收集消化液，轻揉血管，并用M199培养液反复冲洗静脉腔，使血管内皮细胞脱落。

收集冲洗液于离心管中，室温下离心。去上清，加入1.5 mL M199完全培养液(内含体积分数10%胎牛血清和25 μg/L血管内皮生长因子)重悬沉淀细胞，放入细胞培养瓶中，倒置显微镜观察后放入37 ℃含体积分数5%CO₂恒温培养箱中，饱和湿度孵育培养置于37 ℃ 5%CO₂培养箱内进行培养。5-7 d 后可传代，3-5 d后可传一代，取2-4代细胞用于实验，每一代细胞均留取样本行免疫组织化学检测Ⅷ因子蛋白表达，实验用2-4代生长旺盛的细胞。

细胞种植：取2-4代生长良好、稳定的犬血管内皮细胞，经2.5 g/L胰酶消化，计数血管内皮细胞浓度4× 10⁶ L^-1，将上述细胞制成细胞悬液。将圆形的胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜材料在无菌条件下置入96 孔板中，分别接种25 μL细胞悬液，细胞数为1×10⁶个，均匀接种。置含体积分数5%CO₂、37 ℃的恒温培养箱内静置3 h，然后吸掉未贴壁细胞。然后加入1 mL 20% DMEM 培养液，置于孵箱中相同条件下培养，每天换液1次。将细胞悬液接种于胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜，静置2.0-3.0 h，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液浸没，分两组，将第一组胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜继续置于37 ℃孵箱中静态培养3周，第二组胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜置于特制动态旋转培养装置中培养3周(动态培养装置：通过自行设计微型马达驱动，使置于旋转部件上的管形支架绕其正中长轴作缓慢旋转，装置转动速度60 (°)/min)。

扫描电镜观察：第一组胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜继续置于37 ℃孵箱中静态培养3周，第二组胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜置于特制动态旋转培养装置中培养3周，分别在培养3，7，14，21 d后取出部分材料，用2.5%戊二醛固定，乙醇梯度脱水，临界点干燥，喷金，于扫描电子显微镜下观察细胞在材料上的附着情况，具体按以下步骤处理：置于PBS中清洗，清除表面可能的污物；2.5%戊二醛溶液中固定24 h；PBS冲洗4次，每次15 min；用体积分数50%，70%，90%，100%乙醇逐级脱水，每次15 min，再置于加无水氯化钙的醋酸异戊酯中置换30 min，中间换液1次；然后进行临界点干燥，黏台、喷金，最后在于Philips 525M 型扫描电子显微镜下观察犬血管内皮细胞在材料上的附着情况及形貌和界面情况。

苏木精-伊红染色：按照常规苏木精-伊红染色步骤进行，切片经苏木精-伊红染色后，彻底脱水透明，用中性树胶封盖，镜下观察。

MTT法检测细胞增殖：

常温材料浸提液的制备：将灭菌备用的胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜 0.2 g加入1.0 mL生理盐水中，在37 ℃下惰性容器中浸提5 d。

高温材料浸提液的制备：将灭菌备用的胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜0.2 g加入1.0 mL生理盐水中，置入耐高温惰性玻璃容器中在121 ℃下浸提0.5 h。

实验分组及干预：按ISO要求用高密度聚乙烯膜片作为阴性对照，其大小与与96孔板孔底大小形状一致，灭菌备用；用苯酚作材料作为阳性对照，质量浓度为 64 g/L，过滤除菌备用。将96孔细胞培养板分成4组：常温材料浸提液组、高温材料浸提液组、阳性对照组和阴性对照组。用细胞培养基配制1×10⁷L^-1浓度的犬血管内皮细胞，分注于96孔培养板内，每孔200 μL，每组每观察期8孔，置含体积分数5%CO₂、37 ℃的恒温培养箱内，培养24 h使细胞贴壁。24 h后弃去原培养基，常温材料浸提液组加常温材料浸提液和细胞培养基各 100 μL，高温材料浸提液组加高温材料浸提液和培养基各100 μL，阳性对照加64 g/L的苯酚和培养基各100 μL，阴性对照加灭菌备用的高密度聚乙烯膜片后，加生理盐水和培养基各100 μL。置含体积分数5%CO₂、37 ℃的恒温培养箱内。培养72 h后分别在倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化和生长状况，并进行照相。于各组培养板孔内加入20 μL/孔的MTT液，继续培养6 h，吸去原液，加入200 μL/孔的二甲基亚砜，振荡10 min，在酶标仪上以570 nm波长测定吸光度值(A值)。

主要观察指标：血管内皮细胞与胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜材料复合培养的增殖能力。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，组间资料分析采用单因素方差分析，使用SPSS 10.0统计软件包进行分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

目前应用于临床治疗的人工心脏瓣膜主要有生物瓣和机械瓣两种。生物瓣具有很好的生物相容性，置入后不需或只需短期抗凝。但由于生物瓣容易钙化、衰败、破损撕裂等原因使得它的使用寿命很短，从而严重限制了它的临床应用范围，至今为止仍然没有有效提高生物瓣使用寿命的方法。现在所使用的人工机械瓣膜材料主要是热解碳，但热解碳并不是理想的材料，尽管在瓣膜的制作方面已经有了很大的进步，仍然不能完全避免血栓的形成。当血液与机械瓣膜直接接触时便激活了血小板，从而导致血栓形成，所以血栓形成仍然是主要问题^[1-5] ，术后需终生服用抗凝药以防止血栓形成^[6] 。如果抗凝药使用不当既影响瓣膜的启闭功能，又可引起身体重要脏器的栓塞；抗凝药使用过量容易引起出血倾向。因此，如能获得临床上理想的人工机械瓣膜，使瓣膜上无血栓形成，将解除心血管患者术后需终生服用抗凝药物的痛苦^[7-8] 。
组织工程技术的发展人们开始了组织工程心脏瓣膜的研究^[10-11] ，它采用组织工程学的方法把细胞种植在可降解的心脏瓣膜支架上，在体外培养出的具有完全功能的心脏瓣膜，置入人体后短期内可以代替原有的心脏瓣膜行使功能，经过一段时间后支架被人体组织吸收代谢，并且可以再生出患者自身新的瓣膜。它不仅具有良好的生物相容性和与细胞间质增殖同步降解的特性，而且还应具有诱导细胞产生组织构建、生长和修复的能力，它与移植细胞共同作用最终形成具有三维结构的活体瓣膜组织^[1-4] ，这样可构建成一种无免疫原性、有活力、耐久性强、生物相容性好、无需抗凝的生物瓣膜，以至众多学者对它产生了浓厚的兴趣^[13-16] 。
多孔材料羟基磷灰石是一种具有很大应用前景的生物医用活性陶瓷材料，因为其化学成分和骨相似^[17-20] ，所以和其他移植物相比，合成羟基磷灰石有着极好的生物相容性，组织细胞很容易在它的表面生长。用脉冲激光沉积方法在人工心脏机械瓣膜上沉积胶原包埋羟基磷灰石涂层，让血管内皮细胞在其上面生长，可以制造出一种既有良好血液相容性又有良好机械性能的人工心脏瓣膜。胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜支架材料的主要成分是羟基磷灰石和胶原，其成分和多孔隙及孔隙相通的特殊结构为细胞生长提供良好的天然环境和基质，亦为细胞和支架材料之间提供了最大面积的接触与贴附，并且其缓慢的降解过程中有益血管内皮细胞形成内皮细胞层。
体外三维细胞培养方法包括静态培养体系和动态培养体系^[20-22] 。传统的静止培养方法在应用中已暴露出其缺陷，可能由于静止培养体系内气体、营养成分和代谢废物的扩散不均匀，容易产生载体内代谢废物的蓄积，局部pH值升高，中心部位的细胞因不能获得充分的养分生长迟缓和停滞^[22-24]。动态培养是在培养过程中通过旋转作用使各部位细胞所处环境条件基本一致，去除微重力等因素影响，使细胞生长均一致，形成均匀的细胞层。由旋转生物反应器发展成的旋转细胞培养系统，通过整个容器绕水平轴匀速旋转，使培养液和培养物做近似自由落体的运动，从而模拟一种微重力环境，能使培养物始终处于悬浮状态，而又避免了较大的剪切力和气泡的产生，系统中的微载体受到的最大剪切力仅为0.06 Pa。通过降低转速和减少剪切力可以减少细胞的凋亡，促进增生^[24-26] 。在动态培养体系中模拟体内环境，在胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜支架材料可以看到完整的内皮细胞层，从而彻底解决机械瓣膜的凝血问题，为研制既具有机械瓣优点又具有组织工程瓣优点的人工心脏瓣膜奠定坚实的基础。
实验采用胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜支架材料与犬血管内皮细胞体外复合培养，倒置显微镜发现材料周围细胞生长无异常，电镜发现动态培养体系的细胞在材料表面能很好地均匀黏附、伸展、繁殖，进入并附着在支架内的孔壁上，培养3 d时见胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜支架材料的表面有细胞附着，细胞已伸展成梭形或多角形，伸出伪足黏附于材料上；第7天可见材料表面细胞充分伸展，细胞相互连接融合；在动态旋转培养装置复合培养后到第21天时可见均匀细胞融合成片并将材料表面均匀覆盖，在静态培养中细胞成堆，分布不均匀，部分区域有细胞外基质形成，细胞已完全牢固地附着于材料的表面，这些都表明该材料对细胞无毒性，具有良好的细胞相容性。下一步将进行胶原复合羟基磷灰石薄膜置入犬心脏中，模拟体内升主动脉的实际情况和真实微环境以了解支架材料在体内的再细胞化能力，从而对支架性能作全面的验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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多孔材料羟基磷灰石是一种具有很大应用前景的生物医用活性陶瓷材料，因为其化学成分和骨相似，所以和其他移植物相比，合成羟基磷灰石有着极好的生物相容性，组织细胞很容易在它的表面生长。用脉冲激光沉积方法在人工心脏机械瓣膜上沉积胶原包埋羟基磷灰石涂层，让血管内皮细胞在其上面生长，可以制造出一种既有良好血液相容性又有良好机械性能的人工心脏瓣膜。胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜支架材料的主要成分是羟基磷灰石和胶原，其成分和多孔隙及孔隙相通的特殊结构为细胞生长提供良好的天然环境和基质，亦为细胞和支架材料之间提供了最大面积的接触与贴附，并且其缓慢的降解过程中有益血管内皮细胞形成内皮细胞层。
体外三维细胞培养方法包括静态培养体系和动态培养体系。传统的静止培养方法在应用中已暴露出其缺陷，可能由于静止培养体系内气体、营养成份和代谢废物的扩散不均匀，容易产生载体内代谢废物的蓄积，局部pH值升高，中心部位的细胞因不能获得充分的养分生长迟缓和停滞。动态培养是在培养过程中通过旋转作用使各部位细胞所处环境条件基本一致，去除微重力等因素影响，使细胞生长均一致，形成均匀的细胞层。由旋转生物反应器发展成的旋转细胞培养系统，通过整个容器绕水平轴匀速旋转，使培养液和培养物做近似自由落体的运动，从而模拟一种微重力环境，能使培养物始终处于悬浮状态，而又避免了较大的剪切力和气泡的产生，系统中的微载体受到的最大剪切力仅为0.06Pa。通过降低转速和减少剪切力可以减少细胞的凋亡，促进增生。在动态培养体系中模拟体内环境，在胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜支架材料可以看到完整的内皮细胞层，从而彻底解决机械瓣膜的凝血问题，为研制既具有机械瓣优点又具有组织工程瓣优点的人工心脏瓣膜奠定坚实的基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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胶原包埋羟基磷灰石涂层人工机械瓣膜对犬血管内皮细胞的毒性

Toxicity assessment of hydroxyapatite-coated mechanical heart valve embedded with collagen to vascular endothelial cells

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